Syntese av DNA og RNA krever vitamin B9 (folat/folsyre). Folat vil gjennom en enzymatisk reaksjon og omdannes til dihydrofolat, deretter til tetrahydrofolat, så 5,10-metylene tetrahydrofolat som metylerer dUMP (forløper til uracil i RNA) som omdannes til dTMP (forløper til thymin i DNA). Midler med denne virkningsmekanismen inhiberer dannelsen av dihydrofolat fra folat og dannelsen av tetrahydrofolat fra dihydrofolat. Når disse to reaksjonene inhiberes, så kan ikke 5,10-metylene tetrahydrofolat dannes, som videre ikke kan metylere dUMP til dTMP. Resultatet blir at thymin ikke dannes, som gjør at bakterien ikke klarer å produsere DNA. Uten DNA kan ikke bakterien dele seg og bakterieveksten stopper opp. Disse midlene er bakteriostatiske. Sulfanomid og trimetoprim er to grupper antibakterielle midler med denne virkningsmekanismen. Sulfanomider inhiberer i dannelse av dihydrofat, mens trimetoprim inhiberer dannelsen av tetrahydrofat. Ofte kombineres de to typene (trimetoprim-sulfa).