| En 32 år gammel mann fra Tromsø har langvarig hoste som også har vedvart etter oppstart behandling mot TB. Han sier selv at han tar medisiner som ordinert, men ifølge tuberkulosekoordinator har samarbeidet med pasienten ikke fungert tilfredsstillende. Pasientens almenntilstand er blitt dårligere, og han skal nå ut på en lengre reise. Etter en periode på 4-6 måneder med mye reising er pasienten igjen dårlig og han synes ikke å ha effekt av antibiotika |
Prøver fra pasienter med høy sannsynlighet for MDR-TB (Multi drug resistent) bør testes for mutasjoner i direkte materiale og/eller kultur for rask avklaring. Det tas derfor ny prøve av pasienten som blir undersøkt for genotypisk resistens med hurtigtesten GenXpert MTB Ultra.
Metoden er en automatisert real- time PCR som både påviser M. tuberculosis-komplekset og genotypisk rifampicinresistens, dvs. mutasjoner i genet som koder for RNA polymerase B (rpoB). Hele prosessen med DNA-ekstraksjon, amplifikasjon og deteksjon foregår i en lukket engangsbeholder (kassett) som er tilsatt PCR-reagenser. Det benyttes 4 spesifikke primere som oppformerer et 81 bp langt segment av rpoB-genet ved en sanntids PCR og 6 ulike hybridiseringsprober. Probene komplementerer hverandre og dekker til sammen hele kjerneregionen av rpoB-genet. Probene avgir fluorescens når de folder seg ut og hybridiserer til sitt genområde, som måles ved cycle threshold (Ct)-verdien. M. tuberculosis identifiseres hvis «probe for deteksjon av MTB» gir positivt signal med Ct ≤ 38.
Påvisning av rifampicinresistens gjøres med smeltepunktsanalyse. Etter endt PCR utførers en smeltepunktanalyse av PCR-produktene i reaksjonen for å detektere eventuelle mutasjoner i rpoB-genet. Smeltepunktsanalysen detekterer kjente mutasjoner i områdene opp mot smeltepunktet til villtypen (uten mutasjoner). Smeltepunktet vil øke eller synke avhengig av hvilken baseendring som er tilstede. GC-bindinger har 3 hydrogenbindinger i motsetning til AT som har to. Sistnevnte vil derfor denatureres raskere og få et lavere smeltepunkt enn GC-bindinger.
Figuren viser mengde produkter over antall PCR-sykler analysert med GenXpert MTB Ultra.
Figuren viser smeltepunktsanalyse for villtype (negativ kontroll) og pasientens prøve, PCR- produktene for rpoB-regionen (y-akse) mot smeltepunkt (temperaturen hvor DNA denaturerer).
Ved mistanke om TB skal alltid prøvematerialet dyrkes. Dyrkning er generelt sett mer sensitivt sammenlignet med direkte påvisning med mikroskopi og PCR. En bakteriekultur er dessuten et kriterium for andre undersøkelser som fullstendig resistensbestemmelse og epidemiologiske undersøkelser som ser på slektsforholdet i smitteutbrudd/tilfeller. Mykobakterier har lang replikasjonstid og spesielle vekstkrav i forhold til mange andre bakterier. Prøvematerialene forbehandles gjerne på forhånd med hensikt å drepe andre typer bakterier. Ved å tilsette natriumhydroksid-løsninger (lut) utnytter man at mykobakteriene er spesielt standhaftige pga. sin tykke og lipidholdige cellevegg. Mykobakteriene tåler denne behandlingen i en begrenset tid, mens "vanlige" bakterier vil drepes. I tillegg benyttes andre vekstmedium. Et alternativ er flytende "7H9"- medium som benyttes i halvautomatiserte instrumenter, som i 42 dager kontinuerlig overvåker for vekst. Det faste vekstmediet "Løwenstein-Jensen" er et annet alternativ.
Prøvematerialet sås ut på Løwenstein-Jensen-rør. Bildet viser vekst av M.tuberculosis som typisk har tørre, blomkål-lignende kolonier.
TB-IGRA (Interferon-Gamma Release Assays) er en immunologisk blodtest som påviser om pasienten har vært eksponert for spesifikke TB antigener. Ved TB-IGRA blir T-celler fra blod stimulert med peptider fra definerte antigener (ESAT-6, CFP-10 og andre MHC antigener) som er spesifikke for M.tuberculosis-komplekset. Hvis cellene responderer med sekresjon av IFN-γ, indikerer dette at det enten foreligger en aktiv eller en latent TB-infeksjon.
Oversiktstabell over TB-IGRA resultat fra pasienten. OBS! Nullprøve er ikke en negativ kontroll, men en test som sjekker utgangspunktet før eksponering for TB- antigen. Skal være positiv.